Оценка STAT5 как потенциальной терапевтической цели при энзалутамид-резистентном раке предстательной железы

Введение:

Несмотря на эффективность энзалутамида в замедлении прогрессирования метастатического кастрационно-резистентного рака предстательной железы (КРРПЖ), резистентность к этому антиандрогену неизбежно возникает. Несколько исследований показали, что сигнальный трансдуктор и активатор транскрипции (STAT) 5 играет роль в прогрессировании опухоли и развитии лекарственной резистентности, такой как энзалутамид. Анализ данных выявил гетерогенную экспрессию STAT5 у пациентов с мКРРПЖ, леченных энзалутамидом, и у пациентов с резистентным к энзалутамиду раком предстательной железы (РПЖ). Анализ изоболограмм показал, что ингибитор STAT5 пимозид в сочетании с энзалутамидом оказывает? аддитивное и синергическое ингибирующее действие на жизнеспособность клеток в используемых моделях. Функциональный анализ с опосредованным siRNA нокдауном STAT5 дал разноречивые результаты. Линия клеток MR49F, полученная из LNCaP, может быть повторно сенсибилизирована к энзалутамиду с помощью опосредованного siRNA нокдауна STAT5b. Напротив, ни STAT5a, ни STAT5b не нокдаунили повторно сенсибилизированные энзалутамид-резистентные клетки LAPC4-EnzaR к энзалутамиду. В заключение, наши результаты указывают на то, что STAT5 может быть возможной целью в подгруппе энзалутамид-резистентного РПЖ. Однако, основываясь на представленных здесь данных, общая роль STAT5 в энзалутамид-резистентности и его потенциал в качестве терапевтической цели не могут быть показаны.

Подробнее:

Рак предстательной железы (РПЖ) является наиболее распространенным видом рака у пожилых мужчин. Согласно текущим данным проектов «Cancer Today» и «Globocan 2018», РПЖ занимает второе место по частоте встречаемости среди всех видов рака: ежегодно диагностируется 1 276 106 новых случаев (Европа 449 761, США 234 278) и ежегодно регистрируется 358 989 смертей, связанных с РПЖ во всем мире (Европа 41 290, США 32 686) [ 1 , 2 ]. Андрогенная депривационная терапия (АДТ) является основным вариантом лечения местно-распространенного или метастатического РПЖ. Однако она неизбежно приводит к прогрессированию заболевания и развитию кастрационно-резистентного РПЖ (КРРПЖ), который в настоящее время неизлечим [ 3 ]. Энзалутамид — нестероидный антиандроген второго поколения, одобренный в 2014 году для лечения КРРПЖ в условиях до и после химиотерапии. Он ингибирует связывание андрогенов с рецептором андрогенов (AR), транслокацию рецептора в ядро, связывание с ДНК и набор корегулятора [ 4 ]. У пациентов с неметастатическим КРРПЖ энзалутамид значительно снизил риск метастазов на 71% по сравнению с плацебо в исследовании PROSPER [ 5 ]. Медиана выживаемости без метастазов составила 36,6 месяцев при применении энзалутамида плюс АДТ по сравнению с 14,7 месяцами при применении плацебо (HR, 0,29; 95% ДИ, 0,24–0,35; P менее0,001) [ 5 ]. Несмотря на свое революционное влияние на лечение КРРПЖ, энзалутамид эффективен только в течение определенного периода до прогрессирования заболевания и возникновения лекарственной устойчивости [ 6 , 7 ]. Механизмы устойчивости к андрогенной депривации еще не полностью изучены. Тем не менее, уже были идентифицированы несколько молекулярных адаптаций, включая амплификацию и мутацию AR, изменения в экспрессии корегулятора и активацию обходных путей [ 6 – 12 ]. Например, мутация AR F877L (альтернативно описанная как F876L на основе более старых геномных построений) была обнаружена в бесклеточной ДНК из сыворотки пациентов с CRPC, прогрессирующих на энзалутамиде [ 13 ]. В клеточных моделях, таких как MR49F, эта мутация вызывала активацию AR несколькими антиандрогенами, включая энзалутамид [ 13 – 15 ]. Однако исследование Робинсона и соавторов показало, что у пациентов с mCRPC, из которых около половины предварительно лечились энзалутамидом, мутация F877L не была обнаружена и, следовательно, кажется редким событием [ 7 , 16 ]. Другой выявленный механизм устойчивости к энзалутамиду обусловлен вариантами сплайсинга AR, такими как AR-V7 [ 17 ]. Ли и его коллеги смогли продемонстрировать, что экспрессирующая AR-V7 клеточная линия 22Rv1 была de novo устойчива к энзалутамиду [ 17 , 18 ]. In vitroИсследования Бишопа и коллег выявили AR-зависимые и -независимые механизмы в моделях клеток, устойчивых к энзалутамиду [ 19 ]. Пухр и др. и Арора и др. определили индукцию экспрессии глюкокортикоидных рецепторов (GR) как общую черту опухолей, устойчивых к энзалутамиду, в доклинических моделях, а также в образцах пациентов [ 20 , 21 ]. Группы доказали, что GR придает устойчивость к антиандрогенам, обходя AR. Недавнее исследование, опубликованное Удхане и др., показало, что лечение энзалутамидом приводит к опосредованной AR активации сигнального преобразователя и активатора транскрипции (STAT) 5, тем самым опосредуя рост РПЖ. Было показано, что STAT5 (который относится к двум тесно связанным белкам, STAT5a и STAT5b ) играет ключевую роль в прогрессировании РПЖ [ 22–25 ]. Экспрессия STAT5 в тканях человеческого РПЖ коррелирует с высокими баллами по шкале Глисона и предсказывает ранний рецидив заболевания после первоначального лечения радикальной простатэктомией [ 26 , 27 ]. Исследования ксенотрансплантатов РПЖ показали, что STAT5 играет решающую роль в возникновении и прогрессировании опухоли, и что высокая экспрессия STAT5 связана с мезенхимальным фенотипом [ 28 , 29 ]. Томас и коллеги сообщили, что экспрессия белка STAT5 увеличивается в человеческом РПЖ во время андрогенной депривации [ 28 ]. STAT5 увеличивает транскрипционную активность AR, влияя на стабильность белка AR в клетках РПЖ in vivo и in vitro [ 12 , 28 ]. Это открытие представляет значительный интерес, поскольку сигнальный путь AR остается активным при CRPC, несмотря на низкие уровни циркулирующих андрогенов [ 30 ].

Чтобы улучшить наше понимание роли STAT5 в резистентности к энзалутамиду, мы оценили его роль в клеточных моделях и оценили его ценность как потенциальной терапевтической мишени при резистентном к энзалутамиду РПЖ in vitro .

Культура клеток:

Линия клеток человеческого РПЖ PC3 была получена из Американской коллекции типовых культур. Клетки C4-2 были предоставлены профессором Тальманном (Бернский университет, Швейцария) [ 33 ]. Устойчивая к энзалутамиду субклеточная линия клеток LNCaP MR49F была предоставлена ​​доктором Гливом [ 19 , 34 ]. Устойчивость к кастрации и устойчивость к энзалутамиду была установлена ​​путем обработки энзалутамидом ксенотрансплантированных мышиных моделей. Чтобы исключить возможность того, что наблюдаемые изменения были вызваны микроокружением мыши, мы выбрали модель CRPC C4-2 в качестве чувствительной к энзалутамиду модели, созданной путем двойного пассирования через мышей, подобных клеткам MR49F ( рис. S1A и S1B ). Клеточные линии LAPC4-CTRL, LAPC4-EnzaR, LNCaPabl-CTRL, LNCaPabl-EnzaR, DuCaP-CTRL и DuCaP-EnzaR были предоставлены профессором Кулигом (Медицинский университет Инсбрука, Австрия), а резистентность к энзалутамиду была разработана методом эскалации дозы ( рис. S1C и S1D ), как описано Хофером и др. [ 35 ]. Культуральные среды, используемые для клеточных линий, перечислены в таблице S1 . Все клетки поддерживались при температуре 37 °C в 5% CO2 . Устойчивость к энзалутамиду была подтверждена увеличением IC50 жизнеспособности клеток ( рис. S1B и S1D ). Тестирование на микоплазму проводилось регулярно с использованием анализа обнаружения Mycoalert (Lonza). Аутентификация клеточной линии проводилась ежегодно с помощью профилирования STR.

Заключение:

В реальных клинических практиках мы наблюдали неоднородный опыт пациентов во время и после лечения DAA. Улучшение симптомов было более выраженным у молодых пациентов, у тех, у кого были исходные проблемы с психическим здоровьем и множественные сопутствующие заболевания.

Лечение наркомании:

Энзалутамид (Astellas Pharma, 3343, номер партии: RS-8BK0189-4) и пимозид (Sigma Aldrich, P1793-500MG, номер партии: SLBL8929V) растворяли в ДМСО в виде 100 мМ исходного раствора и хранили в виде аликвот при -80 °C. Перед проведением экспериментов энзалутамид и пимозид разбавляли в среде для культивирования клеток. Эксперименты с изоболограммами проводили в присутствии 0,001–100 мкМ энзалутамида, как было предложено Loewe et al. [ 36 ]. Все остальные эксперименты проводили в присутствии или в отсутствие 10 мкМ энзалутамида. Контроли содержали ДМСО только в качестве носителя. Для изоболограмм были выбраны три фиксированных соотношения комбинаций (энзалутамид:пимозид: 1:1, 1:2, 1:5) и концентрации энзалутамида в диапазоне от 0,01 до 100 мкМ.

Вестерн-блот-анализ

Для анализа вестерн-блоттинга клетки промывали фосфатно-солевым буфером (PBS), собирали с помощью клеточного подъемника и лизировали в буфере радиоиммунопреципитации (RIPA) с полными таблетками ингибитора протеазы Mini EDTA-free (Roche) и коктейлем ингибитора фосфатазы PhosSTOP (Roche). Концентрацию белка количественно определяли с помощью анализа BCA (ThermoFischer Scientific), как описано ранее [ 37 ]. 20 мкг лизата белка разделяли электрофорезом в SDS-геле с использованием геля NuPAGE™ 4–12% Bis-Tris и переносили на нитроцеллюлозную мембрану с помощью системы сухого блоттинга iBlot (все ThermoFischer Scientific). В качестве стандартов белка использовали 10 мкл Spectra Multicolour Broad Range (ThermoFisher Scientific) и 1 мкл MagicMark™ XP Western Protein Standard (ThermoFischer Scientific). Для обнаружения мембраны инкубировали с субстратом WesternBright Sirius HRP (Advansta). За исключением мембран, показанных на рис. S2C , все сигналы были обнаружены с помощью системы хемилюминесценции Microchemi (DNR Bio-Imaging Systems). Рис. S2C был оцифрован с помощью Odyssey CT (LI-COR). Использованные антитела перечислены в таблице S2 . Денситометрический анализ экспериментов проводился с помощью программного обеспечения Image-Studio Lite 5.2 (LI-COR). Необрезанные изображения вестерн-блоттинга отображаются в дополнительных файлах. Файлы необработанных изображений отображаются в изображениях S1 Raw .

Субклеточное фракционирование

Для субклеточного фракционирования клетки промывали ледяным PBS и напрямую собирали в 400 мкл буфера для цитоплазматического лизиса (10 мМ HEPES pH 7,9, 10 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl 2 , 340 мМ сахарозы, 10% глицерина, 1 мМ DTT, ингибитор протеазы, ингибитор фосфатазы) перед добавлением 0,1% Triton X-100 и инкубацией в течение 5 мин на льду. 200 мкл суспензии использовали для лизатов целых клеток. Для выделения ядерной фракции оставшиеся 200 мкл собирали центрифугированием при 1300 xg в течение 4 мин при 4°C и отделяли от цитоплазматических белков в супернатанте. После разделения добавляли буфер для образцов, и образцы обрабатывали ультразвуком. 20 мкл фракций были использованы для вестерн-блот-анализа. Качество фракций контролировалось путем обнаружения ламина A/C (ядерная фракция) и GAPDH (цитоплазматическая фракция).

Выделение РНК и количественная ПЦР в реальном времени

Клетки высевали с плотностью 500 000 клеток/лунку в 6-луночные планшеты и обрабатывали через 24 ч. Клетки собирали через 48 ч после обработки. Общую РНК выделяли с помощью набора RNeasy Plus Mini Kit, следуя инструкциям производителя (Qiagen). Синтез кДНК проводили с помощью набора для синтеза кДНК iScript Select (Bio-Rad). qPCR была выполнена с использованием MIC qPCR cycler (BioMolecular Systems) и анализов экспрессии генов TaqMan для STAT5a (Hs00559637_g1), STAT5b (Hs00560026_m1), PSA/KLK3 (Hs02576345_m1), Bcl-xL (Hs00236329_m1), Cyclin D1 (Hs01050839_m1) и HPRT1 (Hs02800695_m1, все Applied Biosystems). HPRT1 использовался в качестве референса. Программное обеспечение micPCR использовалось для определения значений Ct. ΔCt = Ct GOI -Ct Значения HPRT1 были рассчитаны и выражены как 2 -ΔCt .

трансфекции siRNA

Для трансфекций siRNA использовались 25 нМ ON-TARGETplus SMARTpool против STAT5a или STAT5b (оба Dharmacon). В качестве контроля использовался ON-TARGETplus Non-targeting Control Pool (Dharmacon). Обратные трансфекции siRNA проводились с помощью Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя.

Измерение жизнеспособности клеток

Жизнеспособность клеток оценивали с помощью анализа восстановления красителя 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенилтетразолийбромид (МТТ) (Roche). Клетки (5000 клеток в 50 мкл) высевали в 96-луночные культуральные планшеты. Через 24 часа клетки обрабатывали, добавляя препарат в различных концентрациях в 50 мкл среды. После 72-часовой обработки добавляли МТТ (0,5 мг/мл) еще на 4 часа. После этого клетки лизировали в растворе, содержащем 10% SDS в 0,01 М HCl. Планшеты инкубировали в течение ночи при 37°C, 5% CO2 . Поглощение регистрировали при 570 нм для каждой лунки с помощью ридера для микропланшетов SPARK 10M (Tecan). Каждый эксперимент проводили в трех повторностях. После вычитания фонового поглощения результаты рассчитывались как x-кратное значение необработанных контрольных клеток.

статистический анализ

Для статистического анализа использовались Prism 8.3 (GraphPad Software) и SPSS Statistics 25 (IBM). Для подгонки кривых доза-реакция использовалась нелинейная регрессия. Различия между группами лечения анализировались с использованием t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± sem для оценки различных средних значений в нескольких повторных экспериментах [ 38 ]. Значения P ≤0,05 считались статистически значимыми. Все различия, выделенные звездочками, были статистически значимыми, как закодировано в подписях к рисункам (*p≤0,05; **p≤0,01; ***p≤0,001). Все эксперименты были выполнены по крайней мере в трех биологических повторах, если не указано иное. Индекс комбинирования (CI) рассчитывался с использованием следующего уравнения: CI = (C A,X /IC X , A )+(C B,X /IC X,B ) [ 39 ].

Полученные результаты

STAT5 крайне гетерогенно экспрессируется в моделях клеток, устойчивых к энзалутамиду



Для оценки экспрессии STAT5a и b в моделях клеток, устойчивых к энзалутамиду, были проанализированы общедоступные наборы данных на предмет экспрессии мРНК STAT5a и STAT5b. Анализ экспрессии мРНК в ксенотрансплантатах CRPC, чувствительных и устойчивых к энзалутамиду, полученных из клеток LNCaP ( GSE55345 ), показал, что STAT5a имел среднюю относительную экспрессию мРНК 0,05279 с дисперсией 0,000 в образцах CRPC, чувствительных к энзалутамиду, и среднее значение 0,06002 с дисперсией 0,003 (Рис. 1А, S1E Рис ) [ 40 ]. Анализ мРНК того же набора данных для STAT5b выявил среднее значение -0,02889 с дисперсией 0,000 в образцах CRPC, чувствительных к энзалутамиду, и среднее значение -0,02889 с дисперсией 0,005 (Рис. 1А, S1E Рис . ). В моделях клеточной линии, полученных из LNCaP и созданных путем увеличения дозы энзалутамида ( GSE130534 ), экспрессия мРНК STAT5a и STAT5b не изменилась (Рис. 1Б) [ 41 ]. Анализ различных моделей клеточных линий, устойчивых к энзалутамиду ( GSE78201 ), также продемонстрировал гетерогенную экспрессию STAT5a (Рис. 1С) и STAT5b (Рис 1D). Более того, анализ набора данных ( GSE78201 ) также показал, что регуляция STAT5a и STAT5b не является одинаковой между родительскими и устойчивыми к энзалутамиду клетками [ 17 ] (Рис. 1С и 1D). По сравнению с их чувствительными к энзалутамиду контролями, устойчивая к энзалутамиду клеточная линия CWR-R1 показала увеличение уровней мРНК STAT5a/b, тогда как устойчивые к энзалутамиду клетки LAPC4 и LNCaP показали снижение экспрессии STAT5a/b. Устойчивые к энзалутамиду клетки VCaP показали снижение экспрессии мРНК STAT5a по сравнению с их чувствительной к энзалутамиду контрольной клеточной линией (Рис. 1С), тогда как уровни мРНК STAT5b не изменялись между клеточными линиями (Рис 1D). Анализ набора данных, опубликованного Абидой и соавторами, выявил крайне неоднородную экспрессию STAT5 у пациентов с мКРРПЖ, которые не проходили гормональную терапию или подвергались ей (Рис. 1E) [ 42 ]. Однако статистически значимых различий между экспрессией мРНК STAT5a или STAT5b между группами не наблюдалось.

Для экспериментов в данном исследовании были выбраны сублинии LNCaP C4-2 (чувствительная к энзалутамиду) и MR49F (устойчивая к энзалутамиду), а также сублинии LAPC4 LAPC4-CTRL (чувствительная к энзалутамиду) и LAPC4-EnzaR (устойчивая к энзалутамиду).

Уровни белка STAT5a/b были заметно выше в клетках MR49F по сравнению с клетками C4-2 (Рис. 2А и 2Б), тогда как уровни белка STAT5a/b в энзалутамид-резистентном LAPC4-EnzaR были аналогичны уровням в энзалутамид-чувствительном LAPC4-CTRL. Обе протестированные энзалутамид-резистентные клеточные линии показали увеличение ядерного уровня STAT5 (Рис. 2С и 2D, S2B Рис . ). Поскольку использованное антитело не может различать обе формы STAT5, мы дополнительно оценили экспрессию мРНК генов STAT5a и STAT5b. Уровни мРНК STAT5a были значительно ниже в клетках MR49F по сравнению с клетками C4-2 (Рис. 2E). Напротив, уровни мРНК STAT5b были значительно повышены в клетках MR49F (Рис. 2F). Та же тенденция была отмечена данными NGS, опубликованными King et al., которые сравнили клетки MR49F с чувствительной к энзалутамиду клеточной линией V16D ( S1F Fig ) [ 7 ]. Сублинии LAPC4 экспрессировали мРНК STAT5a на низком уровне и очень высоком уровне мРНК STAT5b (Рис. 2E и 2F). При сравнении AR и PSA/KLK3 между клетками C4-2 и MR49F, резистентные к энзалутамиду клетки MR49F показали снижение уровня белка AR и белка PSA/KLK3 (Рис. 2G и 2H). По сравнению с клетками LAPC4-CTRL, клеточная линия LAPC4-EnzaR показала снижение уровня белка AR и полное отсутствие экспрессии белка PSA/KLK3 (Рис. 2G и 2H). Другой член семейства белков STAT, STAT3, также был вовлечен в устойчивость к энзалутамиду [ 43 ]. Сравнение экспрессии STAT3 в моделях клеток, устойчивых к энзалутамиду, с его чувствительными к энзалутамиду контролями показало, что STAT3 не был увеличен в моделях, устойчивых к энзалутамиду ( рис. S2A и S2B ). Конститутивно активный STAT3, измеренный по фосфорилированию его тирозина 705, также не был обнаружен. Чтобы проверить, может ли быть активирован STA3, клеточные линии, полученные из LAPC4 и DuCaP, были обработаны IL6, известным цитокином, активирующим STAT3 [ 44 ]. В моделях, полученных из LAPC4, IL6 вообще не вызывал фосфорилирования STAT3, вызванного лечением, тогда как модели, полученные из LNCaP и DuCaP, показали отчетливый сигнал pSTAT3 после лечения IL6 ( рис. S2C ). В целом, STAT5 не следует какой-либо модели экспрессии в линиях клеток РПЖ, устойчивых к энзалутамиду.

Андрогенный рецептор не регулирует напрямую STAT5a или STAT5b

Далее мы оценили, была ли измененная экспрессия STAT5a или STAT5b в MR49F прямым транскрипционным эффектом AR. Для этого были использованы общедоступные наборы данных иммунопреципитационного секвенирования хроматина AR (ChIP-Seq) ( GSE62442 , GSE65066 ,Рис 3) были проанализированы на предмет локусов STAT5a, STAT5b и PSA/KLK3 (положительный контроль) [ 31 ]. В геномной области, окружающей STAT5a/b, мы обнаружили три сайта связывания AR (ARB), которые не были обнаружены ни в одной из исследованных линий клеток (Рис. 3А). В клетках C4-2 эти ARB показали слабое связывание AR, вызванное синтетическим андрогеном Миболероном (Рис. 3Б). Для сравнения, ARB вблизи известного целевого гена AR PSA/KLK3 были обнаружены во всех показанных клеточных линиях (Рис. 3С) и показали гораздо более сильное связывание AR, вызванное миболероном, в клетках C4-2, как это было видно в геномной области, окружающей STAT5a/b (Рис 3D). Для подтверждения этих результатов на уровне мРНК, сигнализация AR была смодулирована в клетках C4-2 путем стероидного голодания в течение 24 часов с последующей обработкой в ​​течение 48 часов 1 нМ синтетического андрогена R1881 или 1 нМ R1881 плюс 1 мкМ и 10 мкМ энзалутамида. Ни один из методов лечения не привел к значительному изменению уровней мРНК STAT5a или STAT5b. Напротив, контроль (PSA/KLK) показал значительное увеличение при обработке R1881, которое могло быть отменено энзалутамидом (Рис 3E). Для проверки результатов в клетках C4-2 были проанализированы несколько общедоступных наборов данных ( GSE40050 , GSE81796 , GSE69896 , GSE78201 ) на предмет STAT5a и STAT5b после лечения энзалутамидом (Рис 3F). Ни один из проанализированных наборов данных не показал значительного изменения уровней мРНК STAT5a и STAT5b после лечения энзалутамидом. Уровни мРНК STAT5a и STAT5b в LNCaP и сублиниях CRPC LNCaP LNCaPabl и C4-2 были оценены в нескольких наборах данных ( GSE40050 , GSE11428 , GSE13332 ) после опосредованного siRNA AR-нокдауна. Этот анализ также не выявил значительного изменения уровней мРНК STAT5b после нокдауна AR (Рис 3G). Аналогично, уровни STAT5a не показали значительного увеличения в клетках LNCaP и LNCaPabl после нокдауна AR. Напротив, C4-2 показал значительное снижение уровней STAT5a после нокдауна AR. В совокупности эти результаты указывают на то, что андрогены не регулируют STAT5a и STAT5b посредством прямого транскрипционного механизма.

Анализ изоболограммы комбинированного лечения ингибитором STAT5 пимозидом и энзалутамидом

Комбинированные схемы лечения рака часто достигают терапевтической эффективности, превышающей наблюдаемую при монотерапии. В поисках более эффективных методов лечения мы протестировали одобренный FDA ингибитор STAT5 пимозид в сочетании с энзалутамидом. Анализ вестерн-блоттинга продемонстрировал снижение общих уровней STAT5 в клетках MR49F и C4-2 ( рис. S3A ), тогда как общие уровни STAT5 в моделях LAPC4 не изменились после лечения пимозидом ( рис. S4A ). Кроме того, во всех протестированных клеточных линиях можно было обнаружить зависящее от концентрации снижение ядерного STAT5 после лечения пимозидом ( рис. S3B , S3C , S4B и S4C ). Более того, мы протестировали ингибирующее действие пимозида на STAT5 при концентрации 10 мкМ путем измерения экспрессии мРНК его целевых генов циклина D1 ( CCND1 ) и BCL-xL ( BCL2L1 ) после лечения. Анализ ПЦР показал снижение по крайней мере одного из целевых генов в клетках C4-2 и MR49F после лечения пимозидом, что указывает на ингибирование STAT5 ( рис. S5B ).

Средние значения IC 50 жизнеспособности клеток C4-2, MR49F, LAPC4-CTRL и LAPC4-EnzaR (Рис. 4А–4D) были исследованы на чувствительность к энзалутамиду и пимозиду и представлены вТаблица 1. Кривые зависимости реакции от дозы показали, что при более высоком соотношении (Enza+Pimo) жизнеспособность клеток снижалась, и клетки становились более чувствительными к более низким концентрациям энзалутамида (Рис. 4). Этот результат также отражается в снижении значений IC 50 при увеличении концентрации пимозида (Таблица 1). CI сублиний LNCaP C4-2 и MR49F ясно продемонстрировал, что все обработки были синергетическими по отношению к жизнеспособности клеток (CIменее1;Рис. 4А и 4Б). Напротив, подстроки LAPC4 LAPC4-CTRL (Рис. 4С) и LAPC4-EnzaR (Рис 4D) показали только аддитивное влияние энзалутамида и пимозида на жизнеспособность клеток.

Влияние нокдауна STAT5a и STAT5b на жизнеспособность клеток в присутствии и в отсутствие энзалутамида

Несколько исследований продемонстрировали, что наряду со способностью пимозида ингибировать фосфорилирование и функционирование STAT5a/b он также может проявлять небольшую активность против других киназ и факторов транскрипции, таких как STAT1 [ 45 , 46 ]. Таким образом, результаты, полученные с пимозидом, были подтверждены специфическим опосредованным siRNA-нокдауном STAT5a и STAT5b ( S6 Рис .). Анализ qPCR показал, что обе обработки siRNA специфически снижали экспрессию мРНК их мишеней ( S6A и S6B Рис .). Направленная STAT5a siRNA показала лишь незначительный эффект на уровни мРНК STAT5b ( S6A Рис .). Данные qPCR также показали, что опосредованный siRNA-нокдаун был достигнут уже через 24 часа после трансфекции и продолжался по крайней мере более 72 часов ( S6C и S6D Рис .). Анализ вестерн-блоттинга также выявил эффективное снижение уровня белка STAT5b в клетках C4-2, MR49F, LAPC4-CTRL и LAPC4-EnzaR ( рис. S6E и S6F ). Для исследования роли STAT5a/b в жизнеспособности клеток были проведены анализы MTT с установленной siRNA (Рис. 5). В отсутствие энзалутамида оба пула siRNA, направленные на STAT5a и STAT5b, вызывали лишь незначительное влияние на жизнеспособность клеток по сравнению с контрольным пулом siRNA (siCTRL) через 72 часа (Рис. 5А и 5Б). Обработка энзалутамидом клеток C4-2, трансфицированных siCTRL, значительно снизила жизнеспособность клеток на 30% (Рис. 5А). Снижение STAT5a или STAT5b в обработанных энзалутамидом клетках C4-2 не показало дополнительного эффекта на вызванное энзалутамидом снижение жизнеспособности клеток. Напротив, энзалутамид оказал незначительное влияние на клетки MR49F, трансфицированные siCTRL или пулом siSTAT5a (Рис. 5Б). Однако обработанные энзалутамидом клетки MR49F, трансфицированные siRNA против STAT5b, показали снижение жизнеспособности клеток примерно до 70% от контроля (необработанные клетки MR49F, трансфицированные siCTRL). На основании этих наблюдений были проведены эксперименты по дозозависимому ответу с концентрациями от 0,001 до 10 мкМ энзалутамида с нокдауном клеток STAT5a или STAT5b в MR49F (Рис. 5С). Как сообщается вРис. 5Б, клетки MR49F, трансфицированные siCTRL или пулом siSTAT5a, показали незначительное влияние на жизнеспособность после обработки энзалутамидом. В клетках MR49F, трансфицированных пулом siSTAT5b, наблюдалось значительное снижение жизнеспособности клеток в ответ на энзалутамид (концентрации 0,1 мкМ и выше). Чтобы проверить, способен ли нокдаун STAT5 повторно сенсибилизировать устойчивую к энзалутамиду модель LAPC4-EnzaR, клетки и их чувствительный к энзалутамиду контроль были трансфицированы siCTRL, siSTAT5a или siSTAT5b и обработаны носителем или 10 мкМ энзалутамидом (Рис. 5D и 5E). Обе сублинии LAPC4 показали снижение жизнеспособности клеток после трансфекции с помощью siSTAT5a в присутствии и в отсутствие энзалутамида. В соответствии с результатами в клетках C4-2, жизнеспособность клеток в LAPC4-CTRL была значительно снижена (~ 70% от необработанного контроля), а siSTAT5b не показала дальнейшего снижения (Рис 5D). Однако, в отличие от линии клеток MR49F, опосредованный siRNA STAT5b-нокдаун не смог повторно сенсибилизировать клетки LAPC4-EnzaR к лечению энзалутамидом (Рис. 5E). Взятые вместе, клетки C4-2 и MR49F, полученные из LNCaP, не были затронуты только нокдауном siRNA, а MR49F, устойчивый к энзалутамиду, мог быть сенситизирован к энзалутамиду посредством нокдауна STAT5b. Напротив, субклеточные линии LAPC4 показали сниженную жизнеспособность клеток после нокдауна STAT5a, а сочетание энзалутамида с нокдауном STAT5a или STAT5b не оказало дальнейшего влияния на жизнеспособность клеток.

Энзалутамид снизил активность AR после отключения STAT5b в клетках MR49F

Чтобы изучить, были ли эффекты на жизнеспособность клеток после лечения энзалутамидом и нокдауна STAT5b обусловлены регуляцией активности AR, мы проверили активность AR косвенно, измеряя экспрессию мРНК клинически значимого целевого гена AR PSA/KLK3 с помощью qPCR. В отсутствие энзалутамида нокдаун STAT5 не оказывал существенного влияния на экспрессию мРНК PSA/KLK3 по сравнению с контролем в сублиниях LNCaP ( рис. S5B ). В присутствии 10 мкМ энзалутамида клетки C4-2, трансфицированные siCTRL или пулом siSTAT5b, показали снижение экспрессии PSA/KLK3 до уровней менее 10% от измеренных в контрольных клетках (Рис. 5F). Напротив, клетки MR49F, трансфицированные siCTRL, показали лишь незначительное снижение PSA после обработки энзалутамидом. Однако уровень PSA/KLK3 снизился до ~36% после обработки энзалутамидом в клетках MR49F, трансфицированных пулом siSTAT5b (Рис. 5F). В совокупности активность AR и жизнеспособность клеток могут быть восстановлены до энзалутамида путем подавления STAT5b в клетках MR49F.

Обсуждение

Нестероидный антиандроген второго поколения энзалутамид является многообещающим средством для пациентов с КРРПЖ до и после химиотерапии и продемонстрировал улучшение выживаемости; однако рецидив и развитие резистентности к терапии остаются основными причинами плохой выживаемости [ 4 , 5 , 47–49 ]. Управление резистентностью к энзалутамиду по- прежнему остается сложной задачей. В недавнем исследовании Udhane et al. путь JAK2/STAT5 может быть идентифицирован как возможная цель во время развития резистентности к энзалутамиду [ 50 ]. В соответствии с исследованием Thomas et al., группа показала увеличение белка STAT5 и экспрессии активности STAT5 во время и после гормональной терапии [ 28 , 50 ] .

Представленный здесь анализ экспрессии мРНК показал, что уровни STAT5a и STAT5b неоднородны в различных энзалутамид-резистентных клеточных линиях и моделях ксенотрансплантатов. Более того, анализ экспрессии мРНК у гормонально наивных и леченных пациентов с мКРРПЖ также показал неоднородный профиль экспрессии мРНК STAT5a или STAT5b [ 16 ]. Однако не удалось продемонстрировать никаких различий в экспрессии мРНК STAT5a или STAT5b между двумя группами пациентов. Поскольку энзалутамид напрямую воздействует на AR, был проведен анализ базы данных ChiP-Seq в локусе STAT5. Эти результаты показали, что вокруг этого локуса нет сайта связывания AR. Чтобы подкрепить результаты ChIP-Seq, мы проанализировали AR-положительные клеточные линии РПЖ после химической AR-блокады энзалутамидом или AR-нокдауна с помощью siRNA. Результаты показали, что не было никакой или не было единообразной регуляции мРНК STAT5a/b.

Как показано здесь, STAT5a или STAT5b не регулируются напрямую AR (Рис 3). Расхождение между уровнями белка и мРНК может быть объяснено влиянием фосфорилированного тирозина 694 на стабильность белка STAT5a/b [ 51 ]. Эта точка зрения подтверждается данными Udhane et al., которые выявили повышение регуляции и активацию JAK2 AR в присутствии энзалутамида, что приводит к увеличению фосфорилирования STAT5a/b [ 50 , 52 , 53 ]. Наш анализ белка MR49F и LAPC4-EnzaR, устойчивых к энзалутамиду, выявил увеличение ядерного белка STAT5a/b по сравнению с их контрольными линиями клеток, чувствительными к энзалутамиду. Было показано, что ядерная локализация отражает активность STAT5a/b, поскольку фосфорилирование STAT5a/b является обязательным для транслокации STAT5 в ядро ​​[ 50 , 52 ]. Было показано, что STAT3 участвует в устойчивости к энзалутамиду. Сообщалось, что конститутивно активный STAT3 участвует в резистентности к энзалутамиду, вызывая нейроэндокринную дифференциацию [ 43 , 54 ]. Ни представленный здесь анализ pSTAT3, ни исследование Udhane et al. не смогли выявить конститутивно активированный STAT3 в моделях, устойчивых к энзалутамиду [ 50 ]. Luo et al. продемонстрировали, что модуляция пути STAT3 приводит к нейроэндокринной дифференциации. Поскольку все используемые здесь модели являются AR-положительными, нейроэндокринную дифференциацию можно исключить [ 54 , 55 ]. Следовательно, фосфорилированный STAT3, по-видимому, не участвует в резистентности к энзалутамиду. Эти результаты снова демонстрируют сложные механизмы, приводящие к резистентности к энзалутамиду при РПЖ [ 19 ].

Ингибитор STAT5 пимозид — это одобренное FDA соединение, используемое для клинического лечения хронического психоза, синдрома Туретта и резистентных тиков [ 56 ]. Более того, в предыдущих исследованиях было показано, что пимозид оказывает противораковое действие на различные опухолевые образования, включая РПЖ [ 45 ]. Изоболограммы комбинированного лечения показали, что увеличение концентрации пимозида с энзалутамидом приводило к синергетическому ингибирующему эффекту на жизнеспособность клеток в сублиниях LNCaP. В отличие от результатов, полученных в клетках C4-2 и MR49F, сублинии LAPC4 показали аддитивный эффект на жизнеспособность клеток после лечения энзалутамидом и пимозидом. Активность пимозида против других киназ и факторов транскрипции, таких как NFκB, STAT1 или STAT3, а также различный молекулярный фон клеток могут объяснить это различие [ 45 , 46 ]. Все протестированные клеточные линии показали снижение жизнеспособности клеток при лечении энзалутамидом и пимозидом. Этот результат соответствует данным, представленным Udhane et al., которые продемонстрировали снижение роста опухоли за счет гибели клеток после лечения комбинацией ингибиторов STAT5 и энзалутамида по сравнению с одиночным лечением [ 50 ].

Из-за активности пимозида против других киназ и для получения более глубокого понимания молекулярных механизмов лечения энзалутамидом/пимозидом было оценено влияние нокдауна STAT5a/b в сочетании с энзалутамидом на жизнеспособность клеток. В отсутствие энзалутамида нокдаун ни STAT5a, ни STAT5b не оказал влияния на жизнеспособность клеток C4-2 и MR49F, тогда как клетки, полученные из LAPC4, показали снижение после нокдауна STAT5a. Этот результат противоречит опубликованным результатам Ахонена и др., которые предположили, что ингибирование STAT5a/b вызывает апоптоз в клетках РПЖ [ 10 ]. Следует иметь в виду, что Ахонен и коллеги использовали разные линии клеток и доминантно-негативную плазмиду сверхэкспрессии для ингибирования STAT5a/b. Таким образом, из-за различий в экспериментальной установке возможны разные результаты. Кроме того, в присутствии 10 мкМ энзалутамида, нокдаун STAT5a или STAT5b не имел дополнительного эффекта в C4-2. Эти результаты приводят к выводу, что синергические эффекты, наблюдаемые на изоболограммах в клетках C4-2 с комбинацией энзалутамида и пимозида, были вызваны нецелевыми эффектами пимозида, как сообщалось ранее [ 23 , 24 ]. Однако в клетках MR49F нокдаун STAT5b и обработка 10 мкМ энзалутамидом привели к снижению жизнеспособности клеток до 70%. Эти ингибирующие эффекты на рост клеток были сопоставимы с чувствительными к энзалутамиду клетками C4-2. Тот же результат был показан на кривой доза-реакция, которая указывает на то, что клетки MR49F с нокдауном STAT5b уже демонстрируют дозозависимое снижение жизнеспособности клеток из-за энзалутамида.

Несколько исследований продемонстрировали, что путь STAT5 не только функционально синергичен с путем AR, но также участвует в регуляции клеточного цикла и апоптоза за счет повышения уровней экспрессии циклина D1 и Bcl-xL [ 57 – 59 ]. Таким образом, STAT5 может играть ключевую роль в прогрессировании РПЖ. Полный нокдаун STAT5 может привести к снижению жизнеспособности клеток [ 28 , 50 , 60 ]. Здесь, в отсутствие энзалутамида, опосредованный siRNA нокдаун STAT5b оказал незначительное влияние на жизнеспособность клеток в тестируемых клеточных линиях. Нокдаун STAT5a не оказал никакого влияния на резистентные к энзалутамиду клетки MR49F, но привел к снижению жизнеспособности клеток в обеих сублиниях LAPC4. В клеточных линиях CRPC STAT5a, как было показано, является потенциальной терапевтической мишенью, и его ингибирование индуцирует апоптоз, вероятно, путем регуляции антиапоптотических белков [ 25 , 61 ]. Кроме того, сообщалось, что STAT5a также взаимодействует с GR [ 62 , 63 ]. Puhr et al. уже сообщали о существенной роли GR в сублиниях LAPC4 [ 21 ]. Следовательно, эффекты, наблюдаемые в этих сублиниях LAPC4 после нокдауна STAT5a , могут возникать из-за его влияния на GR [ 21 , 62 ].

Наше исследование жизнеспособности клеток было расширено путем оценки активности AR после нокдауна STAT5b и обработки энзалутамидом. Как и ожидалось, клетки C4-2 показали снижение PSA/KLK3 до уровней экспрессии ниже 10% по сравнению с уровнями, измеренными в необработанных клетках. Напротив, снижение PSA/KLK3 наблюдалось только в клетках MR49F, когда STAT5b был нокдаун. Этот результат согласуется с результатами, представленными Моханти и др., которые не показали никакой связи между экспрессией STAT5a и активностью AR [ 61 ]. Результаты по жизнеспособности клеток в сочетании со снижением активности AR приводят к выводу, что нокдаун STAT5b, опосредованный siRNA, может повторно сенсибилизировать линию клеток MR49F к лечению энзалутамидом.

Гетерогенность опухоли является одной из самых больших проблем в терапии рака [ 64 ]. Различные молекулярные адаптации являются одной из основных проблем в разработке новых методов лечения [ 8 , 9 , 64 ]. Несколько групп предложили STAT5 в качестве мишени при РПЖ на поздней стадии [ 28 , 50 , 52 , 61 , 65 ]. Представленные здесь результаты показывают, что экспрессия мРНК STAT5a и STAT5b является крайне гетерогенной в резистентных к энзалутамиду линиях клеток РПЖ, тогда как активность STAT5a/b, по-видимому, увеличивается в протестированных линиях клеток. Эффекты специфического нокдауна STAT5a/b на жизнеспособность клеток и сигнализацию AR также, по-видимому, зависят от клеточного фона резистентных клеток, что снова отражает проблемы гетерогенности опухоли при лечении заболеваний на поздней стадии.

Интересно, что химическое ингибирование активности STAT5 пимозидом в сочетании с энзалутамидом показало синергетический эффект на снижение роста клеток. Однако следует отметить, что эти синергетические эффекты пимозида могут быть результатом нецелевых эффектов ингибитора, как это было описано ранее [ 45 , 46 , 61 ]. Кроме того, необходимы дополнительные исследования на моделях in vivo и ex vivo для выяснения роли STAT5 в устойчивости к энзалутамиду. В заключение, основываясь на представленных здесь данных in vitro , его роль в устойчивости к энзалутамиду и его потенциал в качестве терапевтической мишени не могут быть ужесточены.